Isabelle Prévost-Desprez entre à l'Ecole nationale de magistrature au début des années 1980. Substitut du procureur au tribunal de grande instance de Lille en janvier 1985, puis au parquet de Paris en septembre 1988, avant de devenir juge d'instruction en 1992, à Paris. Fin 2003, vice-président chargée de l'instruction au tribunal de grande instance de Nanterre puis, en 2005, vice président de la 15e chambre au sein de la même juridiction.